Primer caso de onicomicosis causada por Cylindrocarpon lichenicola, en un paciente inmunosuprimido en Costa Rica

Presentación de caso

Paciente masculino de 39 años, indígena costarricense, sometido a trasplante renal hacía 3,5 años, debido a insuficiencia renal crónica, con tratamiento inmunosupresor para evitar rechazo, con hipertensión arterial secundaria y bajo control y tratamiento médico. Presentó una lesión e infección en la uña del dedo medio de la mano derecha (Figura 1a).

Se tomaron muestras mediante raspado de la uña por la parte en contacto con el lecho ungueal. Se realizó un examen microscópico directo en hidróxido de potasio (KOH) al 40%, para establecer la presencia de elementos fúngicos. Otras muestras se cultivaron en agar Sabouraud glucosado (ASG, Difco, BD EE.UU) y en agar Mycosel(BD EE.UU), y se mantuvieron a 25 ºC por al menos 22 días, con el fin de obtener colonias de los hongos. La identificación del aislamiento se realizó con base en las características macroscópicas de la colonia y microscópicas mediante la observación de preparaciones con montaje en azul de lactofenol.

A partir del aislamiento obtenido se realizó la extracción del ADN genómico por duplicado. La extracción del ADN se efectuó según el protocolo descrito por Salazar et al.²⁵ El ADN genómico se empleó para amplificar, mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la región del espaciador interno transcrito (ITS, por sus siglas en inglés “Internal Transcribed Spacer”) del ADN ribosomal (ADNr), incluidas las regiones ITS1-5.8S e ITS2, con los imprimadores universales ITS6 (5’GAAGGTGAAGTCGTAACAAGG3’) e ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’)²⁶ y una porción del gen del factor de elongación 1alfa (EF-1α o TEF, por sus siglas en inglés) con los imprimadores ef1 (5`-ATGGGTAAGGA(A/G) GACAAGAC-3`) y ef2 (5`-GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCA TGTT-3`).²⁷ La mezcla de reacción de PCR tuvo un volumen final de 25 μL, compuesta por 11,55 µL de agua nanopura estéril, 2,5 µL de 10x Buffer; 2 µL de cada iniciador (10µM); 2 µL de dNTP’s (2mM); 1,7µL de MgCl₂ (25 mM); 1 µL de BSA (20mg/mL); 0,25 µL DreamTaq^TM de polimerasa (5 U/ μL) DreamTaq^TM (Fermentas, EE.UU); 2 µL de ADN (dilución 1:10, aproximadamente 30 ng). La amplificación se realizó en

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un termociclador Applied Biosystems Veriti^TM(Life Technologies, EE.UU) con el siguiente programa térmico: desnaturalización inicial 94ºC por 3 min; 35 ciclos bajo las siguientes condiciones 45 segundos a 94ºC, 60 segundos a 55ºC (ITS) o 53ºC (EF-1α); 45 segundos a 72ºC y una extensión final durante 5 minutos a 72ºC. El producto de PCR se analizó por electroforesis en gel de agarosa (TopVision^TM, Fermentas, EE.UU) al 1,6% (p/v) en 0,5X tris-EDTA buffer (TBE) y 2 µL de GelRed^TM (Biotium, EE.UU). Las condiciones de la electroforesis fueron 90V durante 60 minutos y la visualización posterior de los fragmentos amplificados se realizó en un transiluminador UV (Uvisave Gel Documentation Systems HD2 LCD®, UVITEC CAMBRIDGE, Inglaterra). El marcador de peso molecular utilizado fue una mezcla de bandas de ADN de 100 pb de diferencia (Gene RulerTM 100 bp Plus DNA Ladder, Fermentas, EE.UU). El fragmento amplificado se purificó mediante vía enzimática, con adición de 4 µL de Exo/ (Exonucleasa I; Fermentas EE.UU) y 2 µL de FastAP (fosfatasa alcalina termosensible; Fermentas EE.UU) e incubación a 37ºC por 15 minutos y luego a 85ºC por 15 minutos, para la inactivación de las enzimas. Los fragmentos purificados se enviaron a secuenciar en ambas direcciones (5’→3’ y 3’→5’) a la compañía Macrogen, Inc. (Corea del Sur), con los iniciadores ITS6 e ITS4 y ef1 y ef2, respectivamente. Las secuencias obtenidas para cada imprimador se analizaron con el programa BioEdit Sequence Alignment Editor version 7.0.5.3 ²⁸ y se obtuvo la secuencia consenso, la cual fue comparada con las secuencias publicadas en la base de datos del Banco de Genes del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information NCBI, USA), mediante la opción BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

El examen microscópico directo de la muestra en KOH al 40% reveló la presencia de elementos fúngicos (Figura. 1b). De las muestras cultivadas en ASG y en agar Mycosel se obtuvieron colonias similares a las descritas para los géneros Cylindrocarpon y Fusarium. En el medio ASG la colonia fue inicialmente de color rosado tenue, de rápido crecimiento, y adquirió con el tiempo un color morado intenso con apariencia alanada blanca, y al reverso una pigmentación de color púrpura (Figuras 2a y b). En agar Mycosel las colonias fueron de color negro y de crecimiento pobre, sobre las cuales se forma posteriormente una capa blanca aterciopelada.

El análisis microscópico de las preparaciones con azul de lactofenol del micelio de las colonias formadas en ASG, mostró hifas hialinas septadas, microconidios ovales y unicelulares, macroconidios cilíndricos de paredes delgadas con dos a cuatro septos, ápice redondeado y base plana (Figura. 2d); clamidodosporas terminales e intercalares agrupadas en cadenas (Figura. 2c). Los tipos de conidios y clamidosporas observados fueron coincidentes con los descritos para C. lichenicola.

El producto de PCR obtenido con los iniciadores ITS6/ITS4 y ef-1/ef-2 correspondió, en ambas muestras, a un fragmento de ADN de aproximadamente 650 y 800 pares de bases (pb), respectivamente. La porción de nucleótidos secuenciada fue de 544 pb para la región ITS y de 710 pb para el gen EF-1α. Para ambas regiones, la secuencia fue idéntica en las dos muestras. En el Banco de Genes del NCBI, la secuencia ITS se alineó con un índice de similaridad de nucleótidos del 100% con dos secuencias (números de accesión DQ 094444 y DQ 094355) de

F.lichenicola (sinónimo C.lichenicola). Por su parte, la secuencia del gen EF-1α se alineó con un 100% de similitud con la secuencia DQ246877, que también correspondió a F. lichenicola. También se obtuvo índices de similaridad del 98%-100 con secuencias de Fusarium solani, para ambas regiones secuenciadas, ITS y EF-1α.

Discusión

El presente estudio describe un caso de onicomicosis causada por Cylindrocarpon lichenicola, en la uña del dedo medio de la mano derecha de un paciente con trasplante renal, tratado en el Hospital Calderón Guardia, en Costa Rica. La identificación del hongo se considera robusta, ya que se basó en una caracterización morfológica y molecular.

En Costa Rica, Fusarium se ha identificado como agente etiológico de onicomicosis en uñas de las manos y de los pies, con una frecuencia del 19,0 y el 17,6%, respectivamente,¹⁶ pero no se determinó la especie (o especies) presente. Esta es la primera vez que se identifica C. lichenicola (sinónimo F. lichenicola) asociado a onicomicosis en Costa Rica. A nivel mundial, las especies F. oxysporum y F. solani son las más comúnmente asociadas a onicomicosis,^15,23,29,30 aunque otras especies como

F. proliferatum, F. verticillioides y F. sacchari también han sido identificadas como agentes causales de onicomicosis, aún en pacientes inmucompetentes.^15,29,30 En cuanto a especies del género Cylindrocarpon, la especie C. detructans se identificó como el agente causal de un caso de onicomicosis en uñas de los dedos del pie, de un paciente brasileño con HIV/AIDS, dedicado a labores de jardinería.¹⁹

F. oxysporum se considera el agente causal de infecciones en uñas de dedos de las manos y de los pies, mientras que F. solani es aislado frecuentemente solo en uñas de los pies, y en menor frecuencia en uñas de la mano.^15,29,30 Cabe señalar que tanto

F. oxysporum como F. solani son especies complejas, es decir, que aunque morfológicamente se consideran una sola especie, en realidad representan un conjunto o complejo de especies (SC “species complex”), FOSC y FSSC,^24,30 respectivamente.

F. lichenicola es una de las especies de FSSC,³¹ lo que coincide con el hecho de que en la presente investigación, el análisis molecular evidenció una alta similitud (98 a 100%) del aislamiento en estudio con F. solani.

Las especies de los géneros Cylindrocarpon y Fusarium son morfológica y taxonómicamente similares. F. lichenicola ha pasado por varios cambios de nombre.^20,31 El hongo fue descrito por primera vez en 1913, por C.B. Massalongo, como

F. lichenicola. En 1916 fue colocado en el género Bactridium como B. lichenicola. En 1939 fue clasificado por primera vez como una especie del género Cylindrocarpon, C. tonkinense Bugn. En 1979, con base en el criterio de prioridad, se ordenó asignar el nombre de la primera especie y se denominó C. lichenicola (C. Massal.) Hawksworth.^20,31 Finalmente, en 2002, el nombre original, Fusarium lichenicola, fue restablecido por Summerbell y Schroers,³² con base en análisis filogenéticos de la subunidad grande del ARN ribosomal (LSU). Estos autores notaron una estricta correspondencia entre los casos de infección en humanos atribuidos a C. lichenicola y aquellos causados por miembros de FSSC. Los análisis mostraron que

C. lichenicola es miembro del FSSC y el nombre F. lichenicola fue restablecido. Las otras especies del género Cylindrocarpon forman un grupo filogenéticamente bien separado de FSSC y otros grupos de Giberella, estado perfecto (sexual) de Fusarium.

Lo anterior implica que en algunos casos de onicomicosis, los aislamientos identificados como F. solani podrían ser F. lichenicola, y viceversa. Es obvio que dadas las similitudes morfológicas, genéticas y epidemiológicas entre F. lichenicola y otros miembros de la especie compleja FSSC, los casos de infección reportados han sido causados por uno u otro. Esto reafirma la necesidad de un diagnóstico correcto del agente causal de la onicomicosis.

La identificación de hongos a nivel de especie por los métodos clásicos es una tarea difícil y demanda mucho tiempo. Se estima entre el 30 y el 50% de error en la identificación de especies de Fusarium con base en la morfología.³³ La experiencia requerida solo está disponible, en la mayoría de los casos, en los laboratorios de referencia, y la identificación es realizada por microbiólogos especializados, pero al menos dos semanas son necesarias para aislar e identificar la especie del hongo. Esto resulta en una alta proporción de casos no identificados a nivel de especie. En este estudio, la aplicación de técnicas moleculares (la amplificación y secuenciación de la región ITS y de una porción del gen EF-1α) fue exitosa y permitió la identificación del aislamiento obtenido como F. lichenicola, lo que corrobora su utilidad para diagnóstico. Ambas regiones han sido utilizadas para la identificación molecular de especies de Fusarium de importancia clínica, incluidas aquellas causantes de onicomicosis.^{7,15,23,24,29,30,33}

Se recomienda utilizar técnicas moleculares para determinar las especies de Fusarium u otros hongos filamentosos no dermatofitos asociadas a la onicomicosis en Costa Rica. Esta información es importante no solo desde el punto de vista epidemiológico, sino debido a las diferencias en susceptibilidad a los antimicóticos entre especies, e inclusive aislamientos dentro de la misma especie,^21,33 lo que permitiría guiar el tratamiento y prescribir antimicóticos alternativos en aquellos casos que no responden al tratamiento inicial.^34,35 En cuanto a Fusarium, se han creado bases de datos de libre acceso con secuencias de diferentes regiones del genoma (ITS, EF-1α y otras), en las que se puede comparar la secuencia de los aislamientos en estudio con aquellas de la base, para una correcta identificación.^24,27,36,37

El paciente del que se aisló C. lichenicola está sometido a tratamiento inmunosupresor debido a su trasplante de riñón.

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La condición de inmunosuprimido o inmunocomprometido ha sido asociada a las infecciones en humanos causadas por hongos del género Fusarium, lo que representa un factor de predisposición o riesgo.¹⁸ Es preciso recordar que especies del género Fusarium son capaces de diseminarse desde las uñas infectadas hacia otros sitios, bajo condiciones favorables.^18,20 Casos de infección diseminada o micetomas a partir de lesiones en uñas de los dedos de la mano o del pie provocados por F. lichenicola, han sido descritos en pacientes inmunosuprimidos en Tailandia,¹³ Bélgica²⁰ e Israel.³⁸

Cylindrocarpon y Fusarium son habitantes comunes de climas tropicales, distribuidos en los suelos, en las partes subterráneas y aéreas de plantas, restos vegetales y otros sustratos orgánicos y, posiblemente, en el agua y el aire. La identificación de C. lichenicola (sinónimo F. lichenicola ) asociado a una onicomicosis localizada no invasiva, en un paciente trasplantado, de una zona rural, sugiere que las personas inmunodeprimidas deben ser adecuadamente educadas sobre las posibles fuentes de agentes infecciosos, en particular acerca de los riesgos que pueden generar la jardinería o la agricultura. Es probable que las infecciones ocurran debido a la oportunidad que estas actividades proveen para el encuentro entre los pacientes susceptibles y los agentes infecciosos.¹³

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