Sensibilidad al fluconazol de aislamientos de

Trichophyton rubrum

(Susceptibility testing of fluconazole to Trichophyton rubrum isolates)

Trabajo realizado en la Sección de Micología Médica, Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad de Costa Rica.

Afiliación de los autores:

1Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica. 2División de Microbiología, Laboratorio Clínico, Hospital Calderón Guardia.

Conclusion: Since the majority of T. rubrum isolates were susceptible to fluconazole, we recommend performing susceptibility tests only in cases of therapeutic failure, especially in patients with onychomycosis for whom treatment may last for several months.

Keywords: Antifungal resistance, fluconazole, onichomycosis, Trichophyton rubrum

Fecha recibido: 26 de febrero de 2013 Fecha aceptado: 31 de octubre de 2013

En las últimas décadas la incidencia de infecciones causadas por dermatofitos ha aumentado considerablemente.1,2 En Costa Rica existen pocas publicaciones al respecto, aunque se conoce que los dermatofitos causan infecciones en piel y sus anexos con frecuencia, y que el agente etiológico más comúnmente aislado es Trichophyton rubrum.3, 4 El fluconazol es un antifúngico ampliamente utilizado en nuestra población como tratamiento para la onicomicosis, el cual tiene una duración de 6-12 meses para las uñas del pie y 3-6 meses para las uñas de los dedos de la mano.5 Por lo tanto, interesa investigar la sensibilidad a este antifúngico de las cepas de T. rubrum que circulan en la población. A pesar de que la comunicación de casos con mala respuesta terapéutica va en aumento a nivel mundial,6,7 hasta el momento son pocos los estudios de sensibilidad realizados para demostrar su resistencia; entre estos, cabe mencionar dos que reportan resistencia a azoles en aislamientos de T. rubrum.8,9 La escasa comunicación obedece en parte a la dificultad que ofrece el montaje de las pruebas de sensibilidad de los hongos filamentosos, donde hay que considerar variables como tiempo y temperatura de incubación de la prueba, medio adecuado para la producción de aleurias y macroaleuriosporas de los dermatofitos, entre otras.10,11 Actualmente el método de referencia para los hongos filamentosos es el documento M38-A2 del Instituto de Estándares de Laboratorios Clínicos (Clinical Laboratory Standards Institute, CLSI, por sus siglas en inglés).12 Sin embargo, su utilidad para los dermatofitos se limita únicamente a fines investigativos y no constituye aún una prueba de rutina. Dada la frecuencia del uso de fluconazol en la población costarricense y la baja sensibilidad de T. rubrum al fluconazol, reportada por otros autores,8,9 en el presente estudio se investigó el perfil de resistencia al fluconazol de cepas T. rubrum aisladas en el medio nacional.

Métodos

Muestras e identificación de T. rubrum: se estudió 80 aislamientos de T. rubrum obtenidos de muestras de piel y sus anexos (Laboratorio Clínico del Hospital Calderón Guardia, Laboratorio de Micología Médica, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica). T. rubrum se identificó por su morfología macroscópica típica en el anverso y reverso de las colonias, en los medios de cultivo de agar glucosado de Sabouraud con y sin cicloheximida. Las cepas de mantuvieron en medio D a temperatura ambiente (20-30oC). Este medio es utilizado para la identificación y el mantenimiento de los dermatofitos, debido a que pone de manifiesto las características macro y microscópicas, y retarda considerablemente el pleomorfismo de estos hongos.13

Prueba de sensibilidad a fluconazol: se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de las cepas, según el método de referencia de microdilución CLSI M38-A2.12 La cepa control fue T. rubrum ATCC 28188.

Antifúngico y diluciones: se preparó una dilución madre de fluconazol en polvo estándar, donado por Stein Laboratories, Costa Rica, en dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma Chemicals Co., USA). Para elaborar la solución madre, el antimicótico se preparó 100 veces más concentrado de lo que se usó; en el caso del fluconazol, la concentración más alta es de 128 µg/ml, por lo que se preparó 12 800 µg/ml. Luego, se prepararon 9 tubos con 1 ml de DMSO cada uno y se hicieron diluciones dobles de la solución madre; las concentraciones en µg/ml fueron 12 800, 6 400, 3 200, 1 600, 800, 400, 200, 100, 50 y 25. De la serie anterior se transfirieron 200 µl a una nueva serie de tubos con 9,8 ml de medio RPMI 1640 (Sigma Chemicals Co., USA). Al finalizar este paso, se contó con 10 ml de las soluciones de antifúngico listas para cargar las microplacas de 96 pocillos. Se procedió a preparar las microplacas colocando 100 ml por pocillo, de cada una de las diluciones de fluconazol. Las concentraciones finales fueron 0,25-128 µg/ml.

Preparación del inóculo: T. rubrum se cultivó en tubos inclinados de agar Avena por 7 días, a 35oC, para la obtención de esporas. Luego, se agregó 1 ml de solución salina estéril (85%) a cada tubo y se pasó un aplicador estéril sobre la superficie del cultivo. Las esporas en suspensión se contaron en un hemocitómetro y, finalmente, se hizo una dilución en RPMI 1640 a una concentración de 1-5 x 104/ml.

Prueba de microdilución en caldo: las placas de microdilución cargadas con el antimicótico se inocularon agregando 100 µl de la suspensión de las esporas a cada pocillo. Los pocillos controles de crecimiento (pocillo 12) consistieron en el inóculo de las esporas y RPMI 1640 sin antimicótico, y el blanco de reactivos fue RPMI 1640 (pocillo 11). La prueba de sensibilidad de cada cepa se realizó en duplicado. La placa de microtítulo se incubó a 28oC por 4 días, y el crecimiento del hongo en los pocillos se leyó de forma visual, comparando con el control de crecimiento. También se realizaron lecturas espectrofotométricas a 450 nm para determinar la absorbancia. El valor del blanco de reactivo (pocillo 12) se restó a los demás pocillos. Se tomó el valor de densidad óptica del pocillo 11 como del 100% de crecimiento. De acuerdo con el método de referencia de microdilución CLSI M38-A2,12 como punto final se tomó el 80% de inhibición respecto al valor del pocillo 11. Por lo tanto, el valor de la CMI fue la concentración del último pocillo (de izquierda a derecha) con un valor de densidad óptica menor que el 20% del control del crecimiento. Este valor se

Acta méd costarric Vol 56 (1), enero-marzo 2014

Sensibilidad antifúngica en Trichophyton rubrum/ Gross-Martínez et al

Cuadro 1. Concentración mínima inhibitoria (CMI) de los aislamientos de Trichophyton rubrum
CMI (µg/ ml) No. de aislamientos (n=80) % de aislamientos
0,25 8 10,00 0,5 9 11,25 1 15 18,75 2 20 25,00 4 10 12,50 8 7 8.75 16 5 6,25 32 2 2,50 64 2 2,50 128 2 2,50

calculó multiplicando el valor de densidad óptica del pocillo 11 por 0,2. Se consideró como resistente a los aislamientos con una concentración > 64 µg/ml.

Resultados

Distribución de los aislamientos de T. rubrum según origen anatómico: de los 80 aislamientos, la mayoría fueron de uñas de pie (68,75%), seguida por la región interdigital del pie (11,25 %), la región inguinal (10,0%), la planta del pie (3,75%) y en un 1,25% para cada una de las siguientes regiones: inframamaria, glúteos, uñas de mano, piel de brazo y pierna. La edad promedio de la población masculina fue de 44 años y el intervalo de 9 a 81 años; en cuanto a la población femenina, la edad promedio fue de 47 años y el intervalo de 15 a 86 años.

CMI de los aislamientos: la mayoría de las cepas de T. rubrum fueron sensibles al fluconazol (95%). En el Cuadro 1 se detalla las CMI respectivas.

De los cuatro aislamientos resistentes al fluconazol, dos procedían de plantas del pie y dos de uñas del pie. Tres de los casos (dos plantas y una uña del pie) eran mujeres de 49, 57 y 69 años, y al examen directo de la muestra se observó micelio hialiano. El otro caso de la uña del pie, era de un paciente masculino de 64 años; a la muestra se le observó en el examen directo abundante micelio hialino artrosporado, semejante a la fase parasitaria que presenta el grupo de los dermatofitos.

Discusión

Esta investigación nace ante la necesidad de estudiar la resistencia al fluconazol de aislamientos de T. rubrum, ya que en la bibliografía, aunque no con frecuencia, se han reportado cepas resistentes.8,9 En el país, así como mundialmente, T. rubrum es el agente etiológico con mayor frecuencia aislado en las dermatofitosis.4 Las pruebas de sensibilidad de los dermatofitos a los antifúngicos no se realizan de rutina; por lo tanto, podría haber cepas resistentes, pero que no se estén detectando, por eso la importancia del estudio.

Como se reportó, los resultados demuestran que la región anatómica más frecuentemente afectada por T. rubrum es la correspondiente a las uñas del pie.13 Esto podría deberse a que zonas de la piel como la interdigital, planta del pie, ingle, inframamaria, glúteos, brazos y piernas son fáciles de tratar y requieren, en la mayoría de los casos, antifúngicos tópicos accesibles sin receta médica, por lo que las personas afectadas no recurren, por lo general, al laboratorio clínico para el diagnóstico de estas micosis superficiales. Las uñas del pie, en cambio, son difíciles de curar y requieren tratamiento tanto sistémico como tópico, e incluso se reporta que el fluconazol produce cura micológica solo en el 90% de los casos,15 por lo que aumenta la posibilidad que estos pacientes requieran un diagnóstico micológico para recibir un tratamiento adecuado.

En el presente estudio se analizaron los aislamientos clínicos utilizando el método de referencia CLSI M38-A2 para hongos filamentos,12 sin embargo, algunos aislamientos presentaron dificultad para esporular, por lo que se siguió la recomendación de Jessup y col11y se utilizó el agar avena para obtener las aleurias de T. rubrum. Aun así, no se logró obtener esporas de todos los aislamientos estudiados, probablemente debido al fenómeno del pleomorfismo documentado en los dermatofitos,16 por lo que no se pudo realizar la prueba de sensibilidad al fluconazol a estas cepas.

Cabe mencionar que debido a que la mayoría de los aislamientos estudiados fueron sensibles al fluconazol, no es recomendable realizar la prueba de sensibilidad de rutina en la población, pero ya que cuatro de los 80 de los aislamientos demostraron ser resistentes, sería importante realizar una prueba de sensibilidad en pacientes con mala respuesta terapéutica, previa consideración de las diferentes factores que puedan llevar a una falla en el tratamiento, como lo son: la farmacocinética del antifúngico, las medidas de prevención para evitar una reinfección o el cumplimiento del paciente en la toma del tratamiento, especialmente en las onicomicosis del pie, ya que el tratamiento oral con fluconazol puede extenderse hasta 12 meses.5,17 Al respecto, las dos cepas de T. rubrum resistentes al fluconazol, de interés particular en el presente estudio, son las aisladas de uñas del pie, ya que como se mencionó, el tratamiento es prolongado y además puede tener efectos colaterales, lo cual tiene su impacto al considerar cuál tratamiento es el más adecuado en pacientes con onicomicosis que no responden adecuadamente al fluconazol. Los resultados concuerdan con los obtenidos por Santos y Hamdan,8 quienes demostraron que T. rubrum tiene baja sensibilidad al fluconazol. En un estudio posterior, Manzano-Gayosso y col,9,18 utilizando el método E-test® encontraron un 12% de aislamientos de T. rubrum resistentes al fluconazol. Este mayor porcentaje de resistencia reportada por los autores podría obedecer a un menor número de aislamientos estudiados (25) en comparación con el presente estudio, donde se analizó 80 aislamientos.

Pero, Carrillo-Muñoz et al19 analizaron por el método de NeoSensitabs® 84 aislamientos de T. rubrum, y observaron un 43% de resistencia al fluconazol. Por lo tanto, estas diferencias podrían deberse a los métodos empleados en los dos estudios anteriores y el presente trabajo, ya que se ha observado una baja correlación entre los métodos de difusión en agar (E-test®, NeoSensitabs®) y el de referencia M-38 A2.20

En conclusión, T. rubrum se aisló más frecuentemente de las uñas del pie, y el 5% de los aislamientos analizados fueron resistentes al fluconazol, por lo que se recomienda realizar un estudio de sensibilidad antifúngica por el método de referencia M-38 A, en casos de pacientes infectados con T. rubrum y que presentan fracaso terapéutico.

Conflicto de interés: ninguno de los autores reporta conflicto de interés al realizar esta investigación.

Agradecimientos: el estudio fue apoyado por la Vicerrectoría de Investigación, Universidad de Costa Rica, proyecto # 803-B1-037.

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